【摘要】 目的 建立苦參素氯化鈉注射液中苦參素含量及有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的高效液相色譜方法。方法 HypersilC18(5μm，4.6mm×200mm)色譜柱;流動(dòng)相：三乙胺磷酸緩沖液(pH 7.2)-乙腈(80：20);流速1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)λ210nm。取三批試藥單點(diǎn)外標(biāo)法測(cè)定苦參素含量，歸一化法測(cè)定制劑中有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果 苦參素濃度在12～1200μg/ml范圍內(nèi)，峰面積(A)與濃度(C)線性良好，回歸方程為(A)=15262759C+24440(r=0.9999)。日內(nèi)日間RSD<1%，平均回收率為100.6%。三批樣品的含量分別為102.9%、102.4%和102.2%，三批樣品有關(guān)物質(zhì)的含量分別為0.31、0.31、0.32。結(jié)論 可以應(yīng)用HPLC測(cè)定苦參素氯化鈉注射液中苦參素的含量和有關(guān)的物質(zhì)，該方法準(zhǔn)確度和精密度高，檢測(cè)限低，適合應(yīng)用于該制劑的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】 苦參素氯化鈉注射液；高效液相色譜法；含量；有關(guān)物質(zhì)
The study of quality about the injection of kurarinone and sodium chloride
【Abstract】 Objective To use liquid chromatograghy(LC)，and to detect the content of kurarinone and correlative matter in the injection of kurarinone and sodium chloride.Methods Chromatograghic column was Hypersil C18(5μm.4.6mm×200mm);mobile phase were the buffer solution of triethylamine phosphoric acid (pH 7.2);acetenitrile(80：20)，flow rate 1ml/min and detection wavelength was 210nm. To use extiernal standard method，detected the content of kurarinone in the three groups of reagent，detected the content of the correlative matter in the reagent with normalized method. Results We found that the content of kuarinoe was 12～1200μg/ml，peak area(a). concentration(c)and linear regression were favorable， regression equation was A=15262759c+24440(r=0.9999)，and RSD<1.in a day or next，the everage recovery was 100.6%， the econtent of kurarinone in the three groups of reagent were 102.9%，102.4% and 102.2%，the content of the correlative matter in the three groups of reagent were 0.31，0.31，and 0.32.Conclusion The study shows that we can detect the content of the kurarinone and correlative matter in the injection of kurarinone and sodium chloride with HPLC， The methods has very good accuracy and precision， it is suitable for the quality control of the reagent， with low detection limit.
【Key words】 kurarinone sodium chloride injection;high-performance liquid chromatography(HPLC);content;correlalive matter
苦參素(Oxymatrine)是從中藥苦豆子中提取的生物堿，98%為氧化苦參堿，具有抗炎、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等生物化學(xué)作用［1］。臨床應(yīng)用的苦參素氯化鈉注射液為每瓶250ml，含0.2g苦參素和2.25g氯化鈉，每次用3瓶，液體用量較大，靜點(diǎn)時(shí)間較長(zhǎng)，為了滿足臨床的需要開(kāi)發(fā)了每瓶100ml，含苦參素0.6g和氯化鈉0.9g的新制劑，從 而減少了臨床應(yīng)用次數(shù)和輸液量，且縮短了靜脈點(diǎn)滴時(shí)間。在參考國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上［2］，本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定制劑中苦參素含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC方法， 該測(cè)定方法為制劑的質(zhì)量研究提供參考。
1 儀器和試藥
1.1 儀器 Waters高效液相色譜系統(tǒng)(600E泵，712自動(dòng)進(jìn)樣品，996PDA檢測(cè)器，在線脫氧機(jī)，Millenium色譜管理系統(tǒng))。
1.2 試藥 苦參素氯化鈉注射液(規(guī)格100ml含苦參堿0.6g，氯化鈉9g；批號(hào)：020621、020622、02623；生產(chǎn)廠家：哈爾濱康信藥物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；苦參素對(duì)照品(黑龍江省藥品檢定所提供);乙腈為色譜純，磷酸、三乙胺為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 色譜柱：HyperSilC18(5μm，4.6mm×200mm)柱；流動(dòng)相：三乙胺磷酸緩沖（三乙胺１０ml溶于800ml水中，用磷酸調(diào)pＨ至7.2，再加水至1000ml）：乙腈（８０：２０v／v）;檢測(cè)波：λ210nm;流速１ml/min;進(jìn)樣量２０μl。
2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性 分別取流動(dòng)相，苦參素氯化鈉注射液及苦參素對(duì)照品適量，流動(dòng)相溶解并稀釋得稀釋溶液，另取苦參素原料適量?jī)煞荩渲?份加6mol/L硝酸0.5ml，另1份加1mol/L氫氧化鈉0.5ml，分別于60℃水浴４h后，用流動(dòng)相稀釋２０倍，得苦參素酸、堿破壞稀釋溶液。取上述溶液２０μl進(jìn)樣，色譜分離，結(jié)果苦參素的保留時(shí)間為6.353min，流動(dòng)相無(wú)干擾峰，酸破壞后降解產(chǎn)物與苦參素分離良好，分離度＞1.5，見(jiàn)圖1。 a 空白溶液；b 苦參素對(duì)照品；c 苦參素氯化鈉注射液； d 酸破壞稀釋溶液；e 堿破壞稀釋溶液；1 苦參素 圖1 系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖
2.3 線性實(shí)驗(yàn) 精密稱取干燥恒重的苦參素的對(duì)照品３０mg，置２５ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度搖勻，得濃度為１.２mg/ml的溶液，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋使苦參素的濃度分別為0.24、0.12、0.048、0.024和0.012mg/ml的系列溶液，分別精密量以上溶液20μl，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分離，以峰面積（A）對(duì)濃度（C）進(jìn)行回歸，得回歸方程為A＝1526275C+24440(r=0.9999，P<0.05)。結(jié)果表明苦參素濃度在0.012～0.24mg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。
2.4 最小檢測(cè)限 取“2.3”項(xiàng)下濃度為0.012mg/ml的溶液，逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣20μl，按上述色譜條件進(jìn)行分離，以信噪比優(yōu)于3：1為有效色譜峰，結(jié)果表明苦參素的最小檢測(cè)限為2.6ng。
2.5 溶液穩(wěn)定性 取“2.3”項(xiàng)下濃度為0.12mg/ml的溶液，分別與0、1、3、5、7、10、15和20h進(jìn)樣20μl，按上述條件進(jìn)行色譜分離，結(jié)果20h內(nèi)溶液穩(wěn)定，濃度為（0.12±0.047）mg/ml，RSD為0.39%。
2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取苦參素對(duì)照品適量，置于100ml容量瓶中，按處方量加入氯化鈉和超純水，分別制備苦參素處方標(biāo)示量的80%、100%和120%三個(gè)濃度供試液。每個(gè)濃度制備5份，即，分別每日5次和每日1次連續(xù)5天制備，取上述各溶液20μl進(jìn)樣，色譜分離紀(jì)錄色譜峰，將色譜峰帶入線性方程計(jì)算側(cè)得值，計(jì)算精密度，結(jié)果RSD＜1%，見(jiàn)表1。 表1 密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 按“2.5”方法制備標(biāo)示含量為80%、100%、120%的三個(gè)濃度溶液5份，按上述色譜方法進(jìn)樣20μl，進(jìn)行色譜分離，得色譜峰（A），將色譜峰代入線性方程計(jì)算側(cè)得值，以側(cè)得值/加入值×100%計(jì)算回收率，結(jié)果回收率在97%～103%范圍內(nèi)，見(jiàn)表2。表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.8 含量測(cè)定 取恒重的苦參素對(duì)照品適量，精密稱量，加流動(dòng)相稀釋，制備苦參素濃度為0.12mg/ml的溶液作為對(duì)照品溶液。另精密量取苦參素氯化鈉注射液2ml，置100ml容量瓶當(dāng)中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μl，按上述色譜條件，對(duì)照品和供試品色譜峰，按外標(biāo)法計(jì)算苦參素的標(biāo)示量百分含量。對(duì)三批苦參素氯化鈉注射液，每批10瓶進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果三批樣品（020621、020622、020623）的含量分別為（102.9±0.87）%、（102.4±0.85）%、（102.2±1.89）%，見(jiàn)表3。表3 三批樣品含量測(cè)定結(jié)果
2.9 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 分別取三批苦參素氯化鈉注射液，每批10瓶，每瓶精密量取2ml，置于10ml容量瓶中加流動(dòng)相至刻度，搖勻，得有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的供試液。在再精密量取上述供試液1ml取于50ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，作對(duì)照溶液。精密量取20μl，按上述色譜條件進(jìn)行分離。調(diào)整儀器靈敏度，使供試液主峰的峰高約為滿量程的20%～40%，用歸一化法計(jì)算除試藥外各有效峰的百分含量，以各有效峰的百分含量總和計(jì)算有關(guān)物質(zhì)含量，另外各有關(guān)物質(zhì)峰面積的總和不得大于對(duì)照溶液的峰面積，即有關(guān)物質(zhì)含量＜2%。結(jié)果表明三批樣品（020621、020622、020623）的有關(guān)物質(zhì)分別為（0.31±0.022）%、（0.33±0.025）%、（0.34±0.029）%，均＜2%，見(jiàn)表4，圖2。 圖2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定色譜圖a 空白溶液；b 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的供試液；c 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的對(duì)照溶液 表4 三批樣品有關(guān)物質(zhì)含量
3 討論
氧化苦參堿(oxymatrine)是從豆科槐屬植物苦豆子及苦參根中提取分離得到的一種雙稠哌啶衍生物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明它有強(qiáng)心、抗心律失常、抗炎抗腫瘤等作用，近年來(lái)它還被用于治療乙型肝炎，取得良好的效果，臨床上廣泛用于治療因腫瘤放療、化療引起的白細(xì)胞減少和慢性乙肝等［3］。通過(guò)對(duì)溶劑、提取次數(shù)、堿化條件的選擇，用離子交換和重結(jié)晶的方法提取純化氧化苦參堿。其工藝為60％的酒精提取、沉淀、濃縮、酸化后上柱交換，已交換的樹(shù)脂堿化后用氯仿萃取，收干氯仿后用乙醚萃取，沉淀用丙酮結(jié)晶得氧化苦參堿。苦參素為氧化苦參堿和氧化槐果堿的混合物，其中氧化苦參堿的含量在98%以上，苦參素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定多采用硫酸滴定薄層掃描等方法繁項(xiàng)，其含量雜質(zhì)無(wú)法計(jì)算［4］。
我們?cè)陬A(yù)試驗(yàn)中探索應(yīng)用氨基柱、C8柱等，均未得滿意的分離效果。這樣應(yīng)用十八基硅烷硅膠未填充劑的ＯＤＳ柱（Ｃ１８），三乙胺磷酸緩沖液（pＨ 7.2）-乙腈（80：20，v／v）為流動(dòng)相，氧化苦參堿色譜峰的柱效＞4000，有關(guān)物質(zhì)的分離度1.5。通過(guò)研究證實(shí)，流動(dòng)相的酸堿度對(duì)氧化苦參堿色譜峰的保留時(shí)間及分離度影響大，所以在應(yīng)用此方法對(duì)氧化苦參堿制劑進(jìn)行含量及有關(guān)物質(zhì)分析時(shí)要加以注意。該方法適合應(yīng)用于苦參素氯化鈉注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中苦參素的含量測(cè)定及該制劑有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，且該方法精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度較高。為苦參素制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了參考的較好的分析方法。
【參考文獻(xiàn)】
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