Determination of metoclopramide in human plasma by RP-HPLC

　　【Abstract】  Objective  To develop a method for the determination of metoclopramide in plasma using RP-HPLC. Methods  The internal standard was diazepam， the samples were extracted by ethyl acetate after basified the plasma.， the column was Hypersil C18， and the mobile phase mixed of methanol: water(75:25) containing 0.03%-triethylamine. The detection wavelength was 276nm. Results  The calibration curves were linear when the metoclopramide concentration in serum in range of 3.7～660.0ng/ml， the limit of detection was 2.0ng/ml，method recovery was 92.7%～97.9%，the RSD of within-day and between-day were less than 10%.Conclusion  The method is simple， sensitive and accurate to monitor plasma concentration during clinical pharmacokenitic study of metoclopramide in human.

　　【Key words】  RP- HPLC；metoclopramide;drug concentration in plasma

　　甲氧氯普胺（Metoclopramide，胃復(fù)安）為多巴胺受體阻滯劑，具有強(qiáng)大的中樞性鎮(zhèn)吐作用，并可促進(jìn)胃及上部腸段運(yùn)動(dòng)，臨床上用于治療癌癥放、化療和手術(shù)后的嘔吐、反流性食管炎、膽汁反流性胃炎等胃腸道疾病。有關(guān)甲氧氯普胺的血清濃度測定方法，國內(nèi)文獻(xiàn)采用紫外薄層掃描［1］，靈敏度低，僅適合大劑量樣品，國外文獻(xiàn)報(bào)道的方法有GC、GC-MS和HPLC［2～4］。本文建立的以地西泮為內(nèi)標(biāo)反相高效液相色譜法測定甲氧氯普胺血濃度與文獻(xiàn)相比［2］，方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高。可用于甲氧氯普胺血清濃度測定及其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。

　　1  材料與方法

　　1.1  藥品與試劑  甲氧氯普胺、地西泮標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國生物制品檢定所，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

　　1.2  儀器  HEWLETT-PACKARD1050型高效液相色譜儀，HP35900D化學(xué)工作站

　　1.3  色譜條件  色譜柱為Hypersil  ODS C18   4.0mm×250mm  φ5nm；流動(dòng)相為含0.03%三乙胺的甲醇：水（75：25），流速1.0ml/min；  紫外檢測波長276nm，靈敏度0.01AuFS；柱溫30℃。

　　1.4  標(biāo)準(zhǔn)溶液配制  精確稱取甲氧氯普胺標(biāo)準(zhǔn)液適量，甲醇溶解、稀釋，配成0.44mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，置4℃冰箱備用。 

　　1.5  內(nèi)標(biāo)溶液配制  精確稱取地西泮標(biāo)準(zhǔn)品適量，甲醇溶解、稀釋，配成0.24mg/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)溶液，置4℃冰箱備用。

　　1.6  樣品處理  取血漿1.0ml于離心管內(nèi)，加入內(nèi)標(biāo)溶液4μl，加入pH 9.0磷酸鹽緩沖液0.4ml，加入乙酸乙酯3ml，旋渦震蕩2min，以2000r/min速度離心10min，取出乙酸乙酯層后，再次加入乙酸乙酯3ml于離心管內(nèi)提取，合并2次乙酸乙酯提取液，40℃恒溫下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)��?0μl甲醇溶解，進(jìn)樣20μl。

　　2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　2.1  色譜與分離  本實(shí)驗(yàn)條件下，樣品提取較干凈，甲氧氯普胺峰與內(nèi)標(biāo)峰分離完全，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)對測定無干擾，色譜圖見圖1、圖2。（略）

　　2.2  線性關(guān)系與最低檢測限  分取空白血漿1ml，分別加入適量甲氧氯普胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成3.7ng/ml、11.0ng/ml、33.0ng/ml、110.0ng/ml、330.0ng/ml、660.0ng/ml系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按前述樣品處理方法提取，進(jìn)樣。以甲氧氯普胺與地西泮二者峰面積比值（Y）和甲氧氯普胺血濃度（X）進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=0.0021X+0.0141，r=0.998；本實(shí)驗(yàn)條件下甲氧氯普胺最低檢出限為2.2 ng/ml。

　　2.3  萃取回收率  精取4份44μg/ml甲氧氯普胺標(biāo)準(zhǔn)溶液6μl，各加入內(nèi)標(biāo)液4μl，其中3份再加入血漿800μl，按前述提取方法提取，進(jìn)樣，測得甲氧氯普胺、內(nèi)標(biāo)地西泮峰面積；其中另一份直接氮?dú)獯蹈桑�加�?0μl甲醇溶解，進(jìn)樣 20μl，測得甲氧氯普胺、內(nèi)標(biāo)地西泮峰面積；前3份樣品中的甲氧氯普胺和地西泮各自峰面積平均值分別與后一份樣品中的甲氧氯普胺和地西泮峰面積值相比，得到甲氧氯普胺萃取回收率為92.2%，地西泮萃取回收率為90.7%。

　　2.4  方法回收率試驗(yàn)  分取空白血漿0.8ml，精確加入甲氧氯普胺標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，使其血濃度為11.0 ng/ml、110.0 ng/ml、660.0 ng/ml，按前述樣品處理方法處理進(jìn)樣，以測定值與加入值的比值計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。表1  甲氧氯普胺方法回收率試驗(yàn)  （略）

　　2.5  精密度試驗(yàn)  分取11.0 ng/ml、110 ng/ml、660.0 ng/ml三濃度甲氧氯普胺標(biāo)準(zhǔn)血樣0.8ml各6份，按前述樣品處理方法進(jìn)樣，計(jì)算日內(nèi)差；每日測定，連續(xù)測定6天，計(jì)算日間差，結(jié)果見表2。表2  甲氧氯普胺精密度試驗(yàn)  （略）

　　3  臨床應(yīng)用

　　25例抽動(dòng)穢語綜合征患者日服甲氧氯普胺15～80mg，連續(xù)服藥2周后， 分別抽取早晨給藥前及給藥后45min血樣，按樣品處理方法提取，測定。測得25例患者給藥前血藥濃度2.7～68μg/L，平均(25.1±19.1)μg/L；給藥45min后血藥濃度6.8～212.9μg/L，平均(62.0±48.5)μg/L。

　　4  討論

　　4.1  提取條件選擇  文獻(xiàn)報(bào)道甲氧氯普胺血樣采用三氯甲烷2次提取［2］，本文在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，三氯甲烷與血漿振蕩時(shí)易乳化，且氯仿層在下層，不易吸取，樣品有較大損耗。后經(jīng)摸索，改用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯與血漿較易分層，且乙酸乙酯位于上層，便于吸取，且樣品提取較完全。

　　4.2  色譜條件選擇  本文曾參考文獻(xiàn)［2］，采用甲醇：1%HAC的不同配比為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲氧氯普胺色譜峰拖尾嚴(yán)重，峰型差，后加入三乙胺，拖尾現(xiàn)象得到抑制，其出峰時(shí)間也提前，經(jīng)摸索采用含0.03%三乙胺的甲醇：水（75：25）為流動(dòng)相，甲氧氯普胺與內(nèi)標(biāo)峰得到完全分離，且峰型較好，柱效高，提高了甲氧氯普胺檢測靈敏度。

　　4.3  檢測波長選擇  采用流動(dòng)相為溶媒，對甲氧氯普胺進(jìn)行 200～500nm紫外掃描，得221.2 nm、276.2 nm、310.0 nm三個(gè)最大吸收波長，其中276.2nm處吸收值略高于其他二波長，故采用276nm為樣品紫外檢測波長。

　　4.4  本實(shí)驗(yàn)建立的反相高效液相色譜法測定人血漿中濃度方法  方法準(zhǔn)確、靈敏度高，可最低測至2.2ng/ml濃度血樣，通過對臨床抽動(dòng)穢語綜合征患者甲氧氯普胺血濃度監(jiān)測，表明該方法能夠滿足甲氧氯普胺生物樣品分析需要。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　1  黃圣凱，路洪，朱慶琪，等.  人血漿中胃復(fù)安的紫外薄層掃描測定法.  中國臨床藥理學(xué)雜志，1986，2(2):70.

　　2  Bishop-Freudling G B， Vergin H.  Determination of metoclopramide in human plasma by HPLC.  J  Chromatogr，1983，273:453.

　　3  Bsteman D N，  Kahn C，  Mashiter K， et al.  Pharmacokinetics and concentration-effect studies with intravenous metoclopramide.  Br J Clin Pharmacol，1978，6:401.